明膠酶譜分析試劑盒
Gelatin Zymography Analysis Kit Ver.710278
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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RTD6143
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明膠酶譜分析試劑盒
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50次
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● 產(chǎn)品組成：
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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保存
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RTD6143-01
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4%濃縮膠聚合溶液A（2×）
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40 ml
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4℃
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RTD6143-02
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4%彩色濃縮膠溶液B（2×）
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40 ml
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4℃
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RTD6143-03
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10%分離膠聚合溶液A（2.5×）
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100 ml
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4℃
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RTD6143-04
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10%分離膠膠溶液B（2×）
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125 ml
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4℃
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RTD6143-05
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10×明膠底物
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30 ml
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RT (配制后-20℃)
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RTD6143-06
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10×復(fù)性緩沖液
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250 ml
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4℃
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RTD6143-07
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10×孵育緩沖液
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500 ml
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4℃
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RTD6143-08
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膠原酶陽(yáng)性對(duì)照
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0.5 ml
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-20℃
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RTD6202
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FastBlue蛋白染色液
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500 ml
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RT
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PL112
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5×蛋白上樣緩沖液 (變性，非還原)
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1 ml
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-20℃
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TG120P
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5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(干粉)
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1 L
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RT
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AP020P
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APS（干粉）
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0.5 g
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RT (配制后-20℃)
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）是一種鋅依賴(lài)性酶，能切割細(xì)胞外基質(zhì)成分，能在一定條件下水解明膠。細(xì)胞內(nèi)的MMP以無(wú)活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)，參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guò)程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。
本試劑盒采用酶譜法（Zymography）檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物明膠的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳時(shí)，SDS與樣本中的MMP可逆性結(jié)合，導(dǎo)致MMP氫鍵和疏水鍵被破壞而不能發(fā)揮分解明膠的作用。電泳結(jié)束后取出凝膠與孵育溶液孵育，MMP恢復(fù)活性，在其遷移位置水解凝膠中的明膠，考馬斯亮藍(lán)染色后凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮白色區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶譜）及活性，其強(qiáng)弱與MMP活性呈正比。
本試劑盒提供明膠酶譜分析的全套試劑，試劑盒可進(jìn)行50 次標(biāo)準(zhǔn)膠（8×10 cm）檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750 個(gè)樣品。試劑盒配套有膠原酶陽(yáng)性對(duì)照，可以有效分解明膠，方便判斷凝膠及電泳體系是否有問(wèn)題。
● 貯存及運(yùn)輸：
按照試劑盒標(biāo)簽貯存；常溫運(yùn)輸；開(kāi)封后試劑盒有效期一年。
● 使用說(shuō)明：
1. 10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少室溫存放時(shí)間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個(gè)月。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10%APS。
2. 10×明膠底物配制：
明膠粉末加入30 ml滅菌水，60℃水浴中徹底融化，冷卻至常溫后使用。明膠底物配制后-20℃貯存。
一 分離膠制備：
1.1參照凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
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10%分離膠
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4%濃縮膠
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5 ml
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1.6 ml
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加入順序
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組份
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1.0 mm厚度凝膠
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1
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10%分離膠聚合溶液A（2.5×）
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2.0
ml
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-
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2
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10%分離膠膠溶液B（2×）
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2.5
ml
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-
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3
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10×明膠底物
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0.5
ml
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-
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4
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4%濃縮膠聚合溶液A（2×）
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-
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0.8
ml
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5
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4%彩色濃縮膠溶液B（2×）
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-
|
0.8
ml
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6
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10％ APS
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50
μl
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16
μl
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7
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TEMED
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5
μl
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1.6
μl
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1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對(duì)于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.4靜置5-10分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后，說(shuō)明凝膠已聚合
二 濃縮膠制備：
2.1去除覆蓋在分離膠上的乙醇層。
2.2按照表格將不同體積成分在一個(gè)小燒杯中混合；最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
2.3將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端。
2.4將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.5靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合（25℃
標(biāo)準(zhǔn)凝固時(shí)間為50分鐘）。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)表格標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)催化劑的加入量。
三 電泳：
3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液的配制：
將一包干粉全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值，pH 8.3-8.5）。電泳前將緩沖液稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
3.2 樣品處理：融化-混合-上樣
3.2.1 將5×蛋白上樣緩沖液（變性，非還原）常溫融化后混勻。
3.2.2 將上樣緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻。
注：由于MMP活性需要二價(jià)陽(yáng)離子，蛋白樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等。
蛋白樣品提取可以選擇RL0120F RIPA裂解液(強(qiáng)，不含抑制劑，不含螯合劑)
3.2.3 快甩離心收集到管底，常溫放置5-10分鐘，不要加熱處理樣品，上樣電泳。
膠原酶陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)上樣5-10 μl。
3.3 電泳：
在電泳槽的內(nèi)槽加入1×電泳緩沖液，輕輕撥出梳子，沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×電泳緩沖液。上樣，恒電壓150 V電泳。
電泳條件（一板膠）
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恒電壓
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起始電流
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終止電流
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電泳時(shí)間
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可選
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150V
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30-40mA
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8-15mA
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50 min+
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冰浴電泳
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四 MMP檢測(cè)：
4.1 漂洗：
取出凝膠，放入容器內(nèi)，加入50 ml蒸餾水漂洗凝膠，搖床慢搖5分鐘，重復(fù)一次。
4.2 復(fù)性：
4.2.1
1×復(fù)性緩沖液配制：
將10×復(fù)性緩沖液用蒸餾水稀釋10倍，如10 ml 10×復(fù)性緩沖液加90 ml蒸餾水。
注：如10×復(fù)性緩沖液由于低溫貯存有析出時(shí)，37℃徹底溶化后再使用。
4.2.2 復(fù)性：
取出凝膠，棄蒸餾水，加入50 ml 1×復(fù)性緩沖液，搖床慢搖30分鐘。
注：復(fù)性結(jié)束后，凝膠呈乳白半透明狀。
4.3 孵育：
4.3.1 1×孵育緩沖液配制：
將10×孵育緩沖液用蒸餾水稀釋10倍，如10 ml 10×孵育緩沖液加90 ml蒸餾水。
4.3.2 孵育：
倒掉1×復(fù)性緩沖液，加入50 ml 1×孵育緩沖，37℃
搖床慢搖10分鐘；
棄1×孵育緩沖液，加入 50 ml 1×孵育緩沖，37℃ 搖床慢搖4小時(shí)-過(guò)夜孵育。
注：陽(yáng)性對(duì)照-膠原酶IV通常37℃孵育3-4小時(shí)即可消化凝膠中的明膠。如樣品中MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至過(guò)夜。
4.4 顯色：
4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝膠中加入50 ml蒸餾水，搖床慢搖5分鐘，重復(fù)一次。
4.4.2 棄蒸餾水，加入50 ml FastBlue染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適），搖床上常溫?fù)u動(dòng)30分鐘-2小時(shí)，凝膠大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域；蒸餾水漂洗2-3次，每次5-10分鐘。
4.5 拍照：
由于考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠背景為藍(lán)色，自然光下拍照效果不好。建議使用凝膠觀察透射燈（貨號(hào)：RT3820）底部打光拍照。
五 實(shí)驗(yàn)示例：
10%分離膠（含明膠底物）
電泳條件：1×TGS
150V 36-12mA 90 min
實(shí)驗(yàn)步驟：
漂洗：蒸餾水漂洗兩次；
復(fù)性：50 ml 1×復(fù)性緩沖液常溫復(fù)性30分鐘；
孵育：50
ml 1×孵育緩沖液37度孵育10分鐘；
50
ml 1×孵育緩沖液37度孵育15小時(shí)；
漂洗：蒸餾水漂洗兩次；
染色：FastBlue染色60分鐘。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：膠原酶消化明膠底物，在70-130 kD區(qū)間產(chǎn)生明亮條帶。
明膠酶譜分析試劑盒（10篇）
使用該產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2021 IF=3.5] Salidroside
protects against ventilation-induced lung injury by inhibiting the expression
of matrix metalloproteinase-9.
Author: Hui
Zhang, Wenwen Dong, Siyuan Li, Yunqian Zhang, Zhou Lv, Lu Yang, Lai Jiang, Tao
Wu & Yan Wang.
Journal: Pharmaceutical
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Institution： Xinhua
Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Paper link：https://doi.org/10.1080/13880209.2021.1967409
2. [2021 IF=2.73] Synovial
mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alleviate chondrocyte
damage during osteoarthritis through microRNA-130b-3p-mediated inhibition of
the LRP12/AKT/β-catenin axis.
Author: Zhenhua
Zeng, Yi Dai, Shuo Deng, Sanbao Zou, Tingyang Dou & Feng Wei.
Journal: Immunopharmacology
and Immunotoxicology. Published in 2022
Institution： Department
of Pain, the First People's Hospital of Jiashan County, Jiaxing
Paper link：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08923973.2022.2038192
3. [2021 IF=4.5] CXCL13
as a Novel Immune Checkpoint for Regulatory B Cells and Its Role in Tumor
Metastasis.
Author: Jun
Ren, Tianxia Lan, Ting Liu, Yu Liu, Bin Shao, Ke Men, Yu Ma, Xiao Liang,Yu-quan
Wei, Min Luo, and Xia-wei Wei
Journal: The Journal
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Institution： West China Second Hospital, Sichuan
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Paper link： http://www.jimmunol.org/cgi/doi/10.4049/jimmunol.2100341
4. [2021 IF=5.075] Protective
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Author: Jie Li, Qianqian Wang, Shuaijun Zou, Juxingsi Song, Peipei
Zhang, Fan Wang, Yichao Huang , Qian He , and Liming Zhang
Journal: Toxins 2023, 15, 283
Institution： Naval Medical University
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5. [2021 IF=4.1] ADAMDEC1 induces
EMT and promotes colorectal cancer cells metastasis
by enhancing Wnt/β-catenin signaling via negative modulation of
GSK-3β.
Author: Yuna Jia, Xiaoyong Huang, Haiyan Shi, MingMing Wang, Jie Chen,
Huahua Zhang, Danyang Hou , Hongmei Jing, Juan Du, Huihui Han, Jing Zhang
Journal: Experimental Cell Research 429 (2023) 113629
Institution：Department of Obstetrics, Affiliated
Hospital of Yan’an University
Paper link： https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2023.113629
6. [2021 IF=8.0] Extracellular
Vesicles Maintain Blood-Brain Barrier Integrity by the Suppression of Caveolin-1/CD147/VEGFR2/MMP
Pathway After Ischemic Stroke.
Author: Yiyang Li, Jiali Chen, Xingping Quan, Ying Chen, Yan Han, Jinfen
Chen, Li Yang, Youhua Xu, Xu Shen, Ruibing Wang, Yonghua Zhao
Journal: International Journal of Nanomedicine 2024:19 1451–1467
Institution：University of Macau
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7. [2022 IF=9.7] Direct contact
between tumor cells and platelets initiates a FAK-dependent F3/TGF-β positive
feedback loop that promotes tumor progression and EMT in osteosarcoma.
Author: Qianyu Shi, Jiuhui Xu, Chenglong Chen, Xueyu Hu, Boyang Wang,
Fanwei Zeng, Tingting Ren , Yi Huang, Wei Guo, Xiaodong Tang, Tao Ji
Journal: Cancer Letters 591 (2024) 216902
Institution：Department of Musculoskeletal Tumor,
Peking University People’s Hospital
Paper link： https://doi.org/10.1016/j.canlet.2024.216902
8. [2022 IF=4.6] Crocin’s role in
modulating MMP2/TIMP1 and mitigating hypoxia?induced pulmonary hypertension in mice.
Author: Jing Deng, Rui?Qi Wei, Wen?Mei Zhang,
Chang?Yu Shi, Rui Yang, Ming Jin，Chunmei Piao
Journal: Scientifc Reports (2024) 14:12716
Institution：Beijing Anzhen Hospital Afliated to the
Capital Medical University
Paper link： https://doi.org/10.1038/s41598-024-62900-8
9. [2023 IF=20.5] Gut–liver translocation of
pathogen Klebsiella pneumoniae promotes hepatocellular carcinoma in mice
Author: Xueliang Wang, Yi Fang, Wei
Liang, Yuhong Cai, Chi Chun Wong, Junlin Wang, Na Wang
, Harry Cheuk-Hay Lau , Ying Jiao, Xingyu Zhou, Liufang Ye,
Mengmiao Mo, Tao Yang, Miao Fan, Lei Song, Heming Zhou , Qiang Zhao, Eagle Siu-Hong Chu,
Meinong Liang, Weixin Liu, Xin Liu, Shuaiyin Zhang, Haitao Shang, Hong Wei,
Xiaoxing Li, Lixia Xu, Bing Liao, Joseph J. Y. Sung, Ming Kuang，Jun Yu.
Journal: Nature Microbiology,Volume 10,January 2025,169–184
Institution：Shenzhen Research Institute, The Chinese
University of Hong Kong, Hong Kong
Paper link： https://www.nature.com/articles/s41564-024-01890-9
10. [2023 IF=5.2] Functional study of Bergeyella
cardium KP-43 subfamily peptidases as putative T9SS cargo.
Author: Tian Li, Yiwen Gao, Xiaoyue Zhang, Yuxiao Zhao,FuyaoHu,WeiLi, Lixiang Li,Hongwei
Pan,YiZhang， Ying Chen
Journal: Communications Biology (2025)8:586
Institution：Qilu Hospital of Shandong University
Paper link： https://doi.org/10.1038/s42003-025-07996-y