動物膜蛋白提取試劑盒（細胞樣品）
(Animal
Membrane Protein Extraction Kit for Cells)
|
產品貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTD8111
|
動物細胞膜蛋白提取試劑盒（細胞樣品）
|
50次
|
● 產品簡介
動物膜蛋白提取試劑盒（細胞樣品）(Animal
Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一種簡便的地從培養(yǎng)細胞或貼壁細胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不僅包括質膜上的膜蛋白，也包括細胞器膜如線粒體膜、內質網膜和高爾基體膜上的膜蛋白。
本產品與許多用于分離膜蛋白的程序不同，該試劑盒不需要超聲，不需要耗時的超速離心，不使用去垢劑，最大限度地保持了膜蛋白在細胞內的原始狀態(tài)。提取的基本原理是通過提取溶液和離心柱的協調作用提取得到高純度的膜蛋白。膜蛋白提取溶液可以溫和作用于細胞膜，改變細胞的滲透壓，然后在高速離心下細胞通過離心柱，這個過程中細胞膜會破裂；收集液700
g低速離心分離去除細胞核，因此消除了膜組分中細胞核組份的污染；隨后上清使用常規(guī)臺式低溫離心機（無需超速離心）16000
g高速離心，沉淀即為膜蛋白。
該產品約60分鐘即可完成培養(yǎng)細胞膜蛋白的提取。膜蛋白是在溫和、非變性條件下提取的，結合不同的溶解液，溶解后的膜蛋白可以用于SDS-PAGE變性電泳檢測、Blue
Native非變性電泳檢測以及等電聚焦電泳等。另外，膜蛋白也可以用于酶活性測定，免疫沉淀，ELISA測定等。
對于細胞樣品，如果每次使用細胞的數量為2-5×106，本試劑盒可以提取125個樣品；如果每次使用的細胞數量為1×107細胞，本試劑盒可以提取50個樣品。
● 產品組成
|
序號
|
產品編號
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
1
|
RTD8111-01
|
膜蛋白提取溶液
|
25 ml
|
4℃
|
|
2
|
PS1020
|
變性蛋白溶解液
|
5 ml
|
RT
|
|
3
|
PN1020
|
膜蛋白重懸液（BN電泳用）
|
5 ml
|
4℃
|
|
4
|
DM1080
|
膜蛋白增溶液A
|
5 ml
|
4℃；
配制后-20℃貯存
|
|
5
|
PL130-01
|
10×膜蛋白A型上樣緩沖液（配套膜蛋白增溶液A使用）
|
1 ml
|
4℃
|
|
6
|
CD-50
|
離心柱套裝
（包含離心柱和2ml連蓋收集管）
|
50個
|
RT
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
說明書
|
-
|
|
● 貯存、效期和運輸：
根據標簽溫度貯存；一年有效；試劑盒常溫運輸。
● 用前必讀：
1. 離心機請調整成RCF/g模式，按照離心力設置離心機（不要根據轉速rpm模式設置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。
2. 將膜蛋白提取溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放置于冰上預冷。
3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照1:100添加，即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
4. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
● 使用方法：
一 培養(yǎng)細胞膜蛋白提?。?/b>
1.1 準備溶液：
混勻膜蛋白提取溶液，立即放置在冰上。取適當量的溶液，在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。按照下表大體估算膜蛋白提取溶液使用體積：
|
細胞類型
|
培養(yǎng)器皿
|
細胞數量
|
細胞沉淀體積（PCV）（μl）
|
膜蛋白提取溶液（μl）
|
|
懸浮細胞
|
|
2-5×106
|
20-50
|
200
|
|
|
5-10×106
|
＞50
|
500
|
|
貼壁細胞
|
96孔板
|
~1×105
|
調整細胞數目到2-5×106
|
200
|
|
24孔板
|
~5×105
|
調整細胞數目到2-5×106
|
200
|
|
6孔板
|
~2.5×106
|
~25
|
200
|
|
25cm2培養(yǎng)瓶
|
~2×106
|
~20
|
200
|
|
75cm2培養(yǎng)瓶
|
~8×106
|
~80
|
500
|
|
35
mm培養(yǎng)皿
|
~2×106
|
~20
|
200
|
|
60
mm培養(yǎng)皿
|
~5×106
|
~50
|
500
|
|
100
mm培養(yǎng)皿
|
~1.5×107
|
調整細胞數目到2-5×106
|
200
|
注：
(二百萬，2×106)HeLa細胞，其細胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
1.2 準備細胞：
1.2.1
對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。400
g（~2000
rpm）
4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。
1.2.2
對于懸浮細胞：400
g（~2000
rpm）4℃離心5
min收集細胞，用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
1.3 裂解細胞膜：
1.3.1細胞沉淀中加入準備好的膜蛋白提取溶液（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3混勻。
注：提取溶液使用推薦經驗值：起始細胞數低于5×106加入
200 μl 提取溶液，起始細胞數量5×106-1×107加入500
μl提取溶液。如果細胞數目低于1×106或高于1×107，建議調整細胞數目在2-5×106范圍內。
1.3.2
將細胞懸液轉移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000
g（~13000
rpm） 4℃離心1分鐘，離心后收集管底部會有沉淀形成。
注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機可以在10秒內達到16000 g。
1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。
1.4 去除細胞核：
溶液700 g（~2700 rpm）
4℃離心1分鐘，用200
μl吸頭小心將上清（上清稍有渾濁）轉移到新的1.5
ml離心管中。注意：轉速不要超過700g，否則會降低膜蛋白的得率。
關鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清（含膜蛋白）中污染核蛋白。如果使用200 μl提取溶液，建議吸取150 μl上清；使用500 μl提取溶液，建議吸取400 μl上清。此步驟得到的細胞核純度不高，混雜有沒有完全破碎的完整細胞，不建議用于相關實驗。
1.5 沉淀膜蛋白：
上清溶液16000
g（~13000
rpm）
4℃離心30分鐘，用200
μl吸頭吸棄上清，沉淀即為提取的膜蛋白。上清是胞漿蛋白，如需要可保存?zhèn)溆谩?
關鍵步驟：此步驟必須完全將上清吸取干凈，可以分次吸取上清，最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈，以免膜蛋白中污染胞漿蛋白。
二 膜蛋白溶解：
膜蛋白沉淀可以根據下游實驗需求用50
μl相應溶解液溶解。
注：不建議加入超過50
μl溶解液，會導致蛋白濃度偏低。
2.1 膜蛋白變性樣品處理：
2.1.1 建議使用50
μl變性蛋白溶解液（貨號：PS1020）溶解膜蛋白；
2.1.2 BCA方法測定蛋白濃度；
2.1.3用變性蛋白溶解液調整蛋白濃度為1
μg/μl，按需分裝，每管50
μl，-80℃保存待用；
2.1.4取一管50
μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨號：PL080，PL113，PL121）處理，建議調整上樣液濃度為0.5
μg/μl；對于多次跨膜蛋白（Multi-pass
membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鐘或者70度處理10分鐘，不要95℃加熱5分鐘，因為在95℃高溫情況下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會聚集，WB檢測會表現為比實際蛋白大小更大的分子量；
2.1.5
使用SDS-PAGE凝膠（貨號：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上樣10-40
μl（5-20
μg）。
2.2 膜蛋白BN非變性樣品處理：
2.2.1 建議使用50
μl膜蛋白重懸液（BN電泳用）（貨號：PN1020）重懸膜蛋白沉淀；
2.2.2 BCA方法測定蛋白濃度（貨號：RTP7102）；
2.2.3
用膜蛋白重懸液（BN電泳用）調整蛋白濃度為1
μg/μl，按需分裝，每管50
μl，-80℃保存待用；
2.2.4 取一管50
μl樣品，溶化混勻后4℃
16000 g 5分鐘，去除上清，保留沉淀；
2.2.5
沉淀中加入50
μl膜蛋白增溶液A（貨號：DM1080），輕柔重懸沉淀，盡量不產生氣泡，冰浴10分鐘；
膜蛋白增溶液A配制方法：在增溶劑粉末管中加入2.5 ml溶解緩沖液，加入超純水精準定容至5 ml，徹底混勻，增溶液中DDM終濃度為1%。
2.2.6
4℃ 16000 g 15分鐘，取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后膜蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此時得到的膜蛋白濃度為1
μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl
β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為1%；
2.2.7
膜蛋白溶液中加入1/10體積10×膜蛋白A型上樣緩沖液（配套膜蛋白增溶液A使用）（貨號：PL130），使用BN凝膠電泳（貨號：RTD6139，RTD6140），每個泳道上樣5-20
μg。
2.3 膜蛋白等電聚焦樣品處理（2D凝膠第一維電泳）：
建議膜蛋白沉淀中使用溶解液：7 M尿素,2
M硫脲,
2%CHAPS,20mM DTT(自備，試劑盒不提供)。
三 關于膜蛋白產量和質量的評價：
3.1 膜蛋白產量：
|
細胞系
|
細胞數量
|
膜蛋白
|
|
K562
|
1×107
|
50-80 μg
|
|
Jurkat
|
1×107
|
80-100 μg
|
|
Hela
|
1×107
|
100-150 μg
|
|
NIH-3T3
|
1×107
|
80-120 μg
|
3.2 膜蛋白質量評價：
膜蛋白質量評價首先看提取的蛋白是否是膜蛋白，其次要看膜蛋白是否有明顯的富集，其三要看提出的膜蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的膜蛋白中是否可以檢測出目的蛋白。使用專門的膜內參檢測（下表），可以初步確認提出的是膜蛋白。膜蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照，與總蛋白相比，膜蛋白中膜蛋白內參是否有明顯富集。膜蛋白中的交叉污染可以用其他組分內參檢測膜蛋白樣品，如關注膜蛋白中是否有細胞核蛋白污染，可以使用核蛋白內參如Lamin
B1檢測膜蛋白，檢測無條帶即說明膜蛋白與細胞核組分無交叉污染。用目標蛋白抗體檢測膜蛋白，驗證是否可以檢測到目的蛋白，蛋白大小是否符合預期。
|
位置
|
內參名稱
|
大小 kD
|
|
細胞膜
|
Na-K ATPase
|
100
|
|
內質網膜
|
Calnexin
|
~90
|
|
線粒體膜
|
COX IV
|
17
|
許多研究人員利用
WB對分離的膜蛋白進行純度檢測，經常發(fā)現一些常用的胞漿內參能在膜蛋白中檢測到，例如β-actin[1],
GAPDH [2] 和 β-tubulin [3]，這是由于這些胞漿內參不僅存在于胞漿也存在于質膜中，因此可以在膜蛋白中檢測到胞漿內參。更多信息，請參閱以下論文：
1.
Gruenstein E., et al. (1975). Actin
associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology.
64:223-234.
2.
Terrasse R., et al. (2012). Human and
pneumococcal cell surface glyceraldehydes
-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human
C1q protein. J. Biol. Chem.
287:42620-42633.
3.
Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica
et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.
四 實驗示例：
樣品：K562細胞，膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白（M）和胞漿蛋白（C），RIPA提取總蛋白（TP）
溫度處理：樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：PL080）混合，37度處理30min，70度處理10min，95度處理5min
電泳：4-18% RealPAGE預制膠（貨號：RTD6119-0420），蛋白上樣量均為5
μg，恒壓200V 55min
轉膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot轉膜緩沖液（貨號：RT5020）濕轉，恒流400
mA 35min。
封閉：快速封閉液（貨號：WR5020） RT 10
min
剝離：Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）
（貨號：WS1200），37度搖床15
min
一抗：1 Na-K ATPase 1:5000；2
Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4
β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7
COXIV 1:5000；常溫搖床孵育60min
二抗：羊抗兔IgG-HRP
1:5000（貨號：HGR1020），羊抗鼠IgG-HRP
1:5000（貨號：HGM1060），常溫搖床孵育60min
檢測：ECL發(fā)光檢測（貨號：EC2520）