單鏈RNA Marker（15-50 nt）
● 產(chǎn)品編號及規(guī)格：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTM505-01
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單鏈RNA Marker（15-50 nt）
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60 μl
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-20℃
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RTM505-02
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2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠，RNase-free)
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1 ml
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-20℃
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● 產(chǎn)品簡介：
單鏈RNA Marker由不同長度的單鏈RNA分子混合而成，5條帶的大小為15，20，25，30， 40，50
nt。樣品保存在 TE緩沖液中，每條帶濃度約為100 ng/μl（配成即用型RNA Marker后，每條帶的濃度約為50
ng/μl）。使用前與等體積2×RNA上樣緩沖液混合即可上樣電泳。該Marker適用于跑尿素變性膠，電泳后可以使用核酸染料如RealSafe
Red（貨號：GR002）或RealSafe
All（貨號：GR004）均可以染色得到清晰的條帶分離效果。
產(chǎn)品內附帶2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠，RNase-free)。以每次上樣5
μl計算，混合好的單鏈RNA
Marker可以使用大約25次。
● 保存條件和運輸：
-20℃貯存，有效期24個月；濕冰運輸。
● 使用方法：
注：以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例，其他規(guī)格凝膠請適當調整。
一. 凝膠制備：
1.1 可以選擇RNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4103））或按照以下程序制膠。
1.2．分離膠配制：根據(jù)表格一，將不同體積的成分混合，漩渦攪拌至尿素徹底溶解。
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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RNA長度
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最佳凝膠濃度
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尿素(克)
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40%PAA
（29:1）
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克
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1 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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40-200 nt
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12%
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2.1克
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1.5 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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6-100 nt
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20%
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2.1克
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2.5 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。
1.5去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積（ml）
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尿素
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40%PAA（29:1）
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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0.84克
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0.2 ml
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0.2 ml
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補至體積2 ml
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20 μl
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2 μl
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1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內，避免產(chǎn)生氣泡。
1.7常溫靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。
二. 樣品制備：
2.1
取適量體積單鏈RNA
Marker樣品與等體積的2×RNA上樣緩沖液 (尿素變性膠，RNase-free)混合，70℃處理5分鐘，冰浴制冷后待上樣。待測樣品也需要進行同樣處理。
三.電泳：
3.1. 預電泳（可選）：電泳槽內外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預電泳30分鐘。電泳結束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去除殘余的尿素。
3.2.上樣：根據(jù)梳齒確定Marker上樣量， 一般是10齒1mm厚梳子Marker上樣5 μl，15齒1mm厚梳子上樣3 μl。
3.3. 連接電源線，打開電源開關，按照以下條件電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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適用條件
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推薦電壓
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200V
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15-20 mA/板膠
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10-15 mA/板膠
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60+ min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)實驗。
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變性膠濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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35 nt
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130 nt
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8%
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19 nt
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75 nt
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10%
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15 nt
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55 nt
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15%
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10 nt
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52 nt
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20%
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5 nt
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35 nt
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四．染色：
單鏈RNA推薦用RealSafe Red（貨號：GR002）或RealSafe
All（貨號：GR004）染色，兩種染料均可以得到清晰的條帶分離效果。
注：其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。
● 注意事項：
1. 單鏈RNA Marker產(chǎn)品適用于變性PAGE垂直電泳，不適用于水平瓊脂糖凝膠電泳。
2. 建議單鏈RNA Marker現(xiàn)用現(xiàn)配，因為混合有上樣緩沖液的單鏈RNA穩(wěn)定性不好。
3. ssRNA實驗樣品序列和實驗樣品上樣量的不同，顯示的片段大小與Marker可能會有微弱的差別。
● 電泳示例：
1. 使用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）染色：
2. 使用核酸快速高靈敏度染色試劑盒（貨號：RTS5101）染色：
