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2×DNA連接緩沖液

2×DNA連接緩沖液

產(chǎn)品編號:RTV701

產(chǎn)品規(guī)格:150ul

數(shù)量
價格 ¥150

2×ligation solution MasterMix

2×DNA連接緩沖液

 

  產(chǎn)品組成:

貨號

名稱

規(guī)格

RTV701

2×ligation solution MasterMix

150 μl

注;按照10μl連接體系計算,每次使用5μl,可以使用30次。

保存:-20

產(chǎn)品簡介:

2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase,ligation buffer2×MasterMix,實驗時,只需加入片段和載體即可進行連接反應(yīng)。

適用于DNA片段和載體DNA的連接以及DNA片段和LinkerAdaptor DNA的連接。

注意事項

12×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase,使用前冰浴中徹底融化,混勻后使用。

2.為了提高轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化時建議所加入連接產(chǎn)物的量不要超過感受態(tài)細胞體積的10%。

使用方法:

DNA片段和載體DNA的連接

1粘性末端的連接

1.反應(yīng)體系:

 

10μl體系

終濃度

線性載體DNA

x μl

10-50 ng

插入DNA片段

y μl

插入片段:載體=1:1-5:1*

2×ligation solution MasterMix

5 μl

ddH2O

up to 10 μl

 

*:載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化:一般vector:insert1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計算片段摩爾數(shù):pmol數(shù)= DNA(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如:插入片段2000bp,線性載體為3000bp,如果載體使用量為50ng0.025pmol),10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3,則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol,插入片段2000bp的使用量為100ng

2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

3.反應(yīng)條件:16孵育30分鐘。

4.可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞。

注:1)若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率,推薦65孵育10分鐘或70孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后,用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后進行電擊轉(zhuǎn)化。

2)若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目,可將連接時間延長至1小時。

2平末端的連接

1.反應(yīng)體系:

 

10μl體系

終濃度

線性平末端載體DNA*

x μl

10-50 ng

插入DNA片段

y μl

插入片段:載體=1:1-5:1**

2×ligation solution MasterMix

5 μl

ddH2O

up to 10 μl

 

*:平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時,應(yīng)首先將載體進行去磷酸化處理,以防止其自身環(huán)化。

**:載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化:一般vector:insert1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計算片段摩爾數(shù):pmol數(shù)= DNA(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如:插入片段2000bp,線性載體為3000bp,如果載體使用量為50ng0.025pmol),10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3,則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol,插入片段2000bp的使用量為100ng。

2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

3.反應(yīng)條件:16孵育30分鐘。

4.可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞。

注:1)若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率,推薦65孵育10分鐘或70孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后,用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉(zhuǎn)化。

2)若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目,可將連接時間延長至1小時。

線性DNA的自身環(huán)化

1.反應(yīng)體系:

 

10μl體系

終濃度

線性載體DNA

x μl

10-50 ng

2×ligation solution MasterMix

5 μl

ddH2O

up to 10 μl

 

2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

3.反應(yīng)條件:16孵育30分鐘。

4.可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞。

注:1)若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率,推薦65孵育10分鐘或70孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后,用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉(zhuǎn)化。

接頭連接


1.反應(yīng)體系:

 

10μl體系

終濃度

線性DNA

x μl

100-300 ng

磷酸化接頭

y μl

0.5-1 μg

2×ligation solution MasterMix

5 μl

ddH2O

up to 10 μl

 

2.徹底輕柔混勻后,瞬間離心,將管壁上的溶液收集到管底。

3.反應(yīng)條件:16℃孵育30分鐘。

4.65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase。連接產(chǎn)物可以直接進行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。



 
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